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Determinación de la secuencia del ADN
25 Nov 2016
El Biophysicist el Dr. Doping cuenta sobre la lectura de secuencias del ADN por el gel electrophoresis y sequencing del genoma humano. ¿Ya que qué logros de Frederick Sanger ganaron dos Premio Nobel en la Química? ¿Cómo hace la lectura de la secuencia de nucleotides en el ADN? ¿Qué método permite separar la Molécula de ADN de la longitud?
Las dos primeras décadas después del inicio de la biología molecular, muy se entendió en cuanto a la naturaleza molecular de la vida, el dogma central famoso se formuló, ha sido completamente descifrado el código genético después del descubrimiento de la doble hélice por Watson y Calambre, que permite que la célula transfiera la proteína de textos de textos de ácidos nucleicos, la secuencia de ADN nucleotides y ARN - en una secuencia de residuos del aminoácido en proteínas. Era un gran logro en el entendimiento de la base molecular de la vida.
La Vitamina B12 de inyección de Cyanocobalamin - es muy esencial para la fabricación de síntesis del ADN.
El problema, sin embargo, consistía en que, aunque los biólogos moleculares siempre hayan hablado de estos textos, nadie sabía los propios textos. No había manera de leer los textos de genes y esto está entre los genes. En otras palabras, no había método para determinar la secuencia de nucleotides en el ADN.
Es capaz de hacer para la proteína - el método de lectura de la secuencia de la proteína se desarrolló a principios de los años 50, hasta antes del descubrimiento de la doble hélice, un poco sepa cómo leer secuencias del ARN cortas, y las secuencias del ADN no podían leer en absoluto. Esto creó un hueco enorme en el verdadero entendimiento de la base molecular de la vida y dificultó el siguiente desarrollo de biotecnología, que, en sentido estricto, no estaba allí, y el uso médico de este conocimiento.
Al mediados 70-ies del XX siglo, había una brecha. Por aquel tiempo, pareció que era demasiado difícil, que no se puede solucionar - todas las tentativas resultaron fracasadas. El método de determinar la secuencia fue desarrollado por el químico británico Frederick Sanger.
Sanger - un gran hombre, el único en la historia de ciencia, quien recibió dos Premio Nobel en la Química. Nobel prohibido dar dos veces el mismo Premio del hombre en la misma área. Pero Sanger había recibido ya el premio por el desarrollo de un método de leer las secuencias de aminoácidos en proteínas. Y cuando desarrolló un método de leer la secuencia del ADN, el comité Nobel estaba en una situación muy difícil: no era un hombre para otorgar un premio para el descubrimiento excepcional o romper el testamento de Nobel. Decidimos a pesar de todo en este caso violan la voluntad, pero lo hacen muy de mala gana. Esto es el único caso en el campo de química. Un caso similar todavía está en el campo de física y todo.
¿Cómo ahora leer la secuencia del ADN? Desde entonces, esta área tiene un progreso enorme, y está basado en una brecha que hizo Sanger. Si hablamos de la longitud de las secuencias del ADN, por ejemplo, queremos determinar la secuencia del genoma humano entero, que es muy fácil ahora hacer - es una longitud del texto colosal. Cada uno de nosotros la célula tiene un genoma que consiste en tres mil millones de nucleotides, tres mil millones de unidades. Esto es tal texto: Un T G C Un T G G G Un T T T C C - algo así, tres mil millones de longitudes. Esto es el texto que se debería leer. No es una molécula del ADN - de hecho tienen 23 años, porque tenemos 23 cromosomas, todavía cada molécula terriblemente mucho tiempo y contiene cientos de millones de unidades.
¿Cómo leerlo? En primer lugar, el ADN se cortó en trozos con enzimas especiales que se llaman «la enzima de la restricción». Las enzimas de la restricción reconocen secuencias del ADN cortas que contienen de aproximadamente 6 a 8 nucleotides, y sólo en este lugar una manera definida cortó el ADN doble hélice. Esto se abre tales «tijeras», también era una brecha a principios de los años 70, cuando se descubrieron, estas enzimas se encuentran en células bacterianas, que producen tal recorte de tales «tijeras» muy específicas. Hay muchos diferentes, por tanto puede cortar el ADN en piezas cortas de un modo, un camino completamente diferente, un tercer camino, un cuarto camino. Esto se hace completamente fácilmente.
Adelante c por el método que se llama «el gel electrophoresis», las Moléculas de ADN se separan muy suavemente de la longitud.
Y la tarea ahora es asegurar que determinen la secuencia de piezas cortas - puede contener cien o varios cientos de unidades. Usa el método de Sanger.
Tal fragmento de la molécula añadió con adaptadores especiales a ambos finales, porque las hojas de la enzima de la restricción endientaron finales que sobresalen partes del hilo y, usando estos fragmentos del hilo solo, el adaptador se puede añadir. El adaptador tendrá cierta secuencia, que hemos elegido, es sintético. Así, cada pieza ahora tiene una secuencia muy definida a los finales de los cuales sabemos. Y podemos usar la secuencia conocida para añadir a estos fragmentos, cartillas, ya que esto estará disponible en la cadena complementaria sintetizada de la secuencia de ADN.
La idea de Sanger consistía en que cuando tal fusión ocurre, es necesario añadir a la mezcla del precursor normal nucleotides, llamado triphosphates tal que no se puede ampliar. Esto es una modificación química especial de un azúcar nucleotide - tal que si nucleotide añadido se incorpora en la cadena, el ADN polymerase no se puede extender más allá de ello. La muestra se divide en cuatro partes, y cada parte, junto con triphosphates normal se añaden triphosphates por medios químicos modificó bases.
Cuando la cadena complementaria se sintetiza con el ADN polymerase, con cierta probabilidad, se para cuando es introducido al azar modificó nucleotide. Como consiguiente, en nuestra muestra en la cual tenemos un número enorme de moléculas idénticas, que es la síntesis, conseguimos un juego de moléculas que tienen esta carta, dicen T o A, que en este caso hemos añadido al fondo de aquellos precursores, añadimos la síntesis del precursor modificada conseguimos una parada en este lugar. Así tenemos la longitud de las moléculas que nos dicen exactamente donde en esta carta se construye. Y luego allí sólo se parte a lo largo de la molécula, que es hecha por el gel electrophoresis. Permite que usted separe estas moléculas de la longitud, y donde está el nucleotide, que estudiamos actualmente, veremos una síntesis de parada, es decir la longitud de los fragmentos, cuando los compartamos de la longitud, correspondiente al número de nucleotides, cuando, supongamos, la carta T está de pie en la secuencia. Esto se hace para la carta T, para la carta A, para la carta G para la carta C, y por tanto leemos la secuencia entera.
Esto es un método maravilloso, ingenioso del secuencial leído, Sanger acuñó. Permitió por último ordenó el genoma humano - se dice a la secuencia el genoma. Y ahora, ya que el primer genoma humano, que se leyó a principios de este siglo, y que cuesta el dinero enorme, sobre mismos tres mil millones de dólares sólo, debido a que estos métodos se robotizaron y pesadamente se modificaron, es ahora gastos mucho más baratos para determinar la secuencia. El precio está cerca de $1,000 - para determinar la secuencia del hombre individual. Ya ordenado los genomas de miles de personas, y se analizan. Es el desarrollo absolutamente increíble de métodos del ADN sequencing ha creado el progreso enorme en el entendimiento de la naturaleza molecular de la vida, y en la aplicación de biotecnología y medicina.
